自從PCR技術(shù)被浪出來：，經(jīng)歷了飛速的發(fā)展和技術(shù)更新，新冠的洗禮，讓所有人都了解到了“核酸檢測”的技術(shù)。

然而，對于初學(xué)者來說，PCR技術(shù)的名稱和原理往往令人感到困惑，傻傻分不清。某個(gè)小伙伴嘗試給讓你搞懂PCR、qPCR、dPCR、RT - PCR 、RT-qPCR、Real-Time PCR之間的區(qū)別和聯(lián)系。

如果你已經(jīng)完全分清了，建議繼續(xù)：

1. 普通PCR(就是只做核酸的擴(kuò)增哦?。。?

聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR），即一代PCR，是1985年由美國PE-Cetus公司的科學(xué)家Kary Banks Mulis發(fā)明的一種可在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的技術(shù)。其原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，在體外條件下以指數(shù)級速度擴(kuò)增，并通過瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。PCR由變性（Denaturation）、退火（Annealing）和延伸（Extension）三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

①變性：通過加熱使模板DNA的雙鏈之間的氫鍵斷裂，雙鏈分開而成為單鏈。這一步驟通常在94℃至95℃的高溫下進(jìn)行，持續(xù)30秒至1分鐘，確保雙鏈DNA完全解離。

②退火（復(fù)性）：當(dāng)溫度降低時(shí)，引物與模板DNA中互補(bǔ)的區(qū)域結(jié)合成雜交分子。退火溫度通常低于引物本身的變性溫度，一般在50℃至65℃之間，持續(xù)30秒至1分鐘，確保引物與模板DNA特異性結(jié)合。；

③延伸（Extension）：在DNA聚合酶、dNTPs（四種脫氧核糖核苷三磷酸）和Mg2+等存在下，DNA聚合酶催化引物按照5′→3′方向延伸，合成出與模板DNA鏈互補(bǔ)的DNA子鏈。延伸溫度通常在70℃至75℃之間，持續(xù)時(shí)間根據(jù)DNA聚合酶的延伸速度和目的擴(kuò)增片段的長度而定。

圖1 PCR的基本反應(yīng)原理

如果想用于核酸的檢測，其實(shí)還需要進(jìn)行凝膠電泳的輔助。所以很多人認(rèn)為的第一代PCR，其實(shí)更應(yīng)該像是凝膠電泳技術(shù)，而不是PCR技術(shù)本身！！！

經(jīng)過演化和革新，PCR技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了三代：普通PCR技術(shù)（PCR+凝膠電泳）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qPCR）以及數(shù)字PCR（dPCR）技術(shù)。

第一代PCR主要缺點(diǎn)：容易發(fā)生非特異性擴(kuò)增和假陽性結(jié)果；檢測耗時(shí)長，操作繁瑣；

只能做定性檢測。目前，在臨床檢測中普通PCR已經(jīng)成為測序等檢測技術(shù)的前處理方法，沒有太多的獨(dú)立應(yīng)用空間。在食品藥品等檢測和分型中，還是不少國家標(biāo)準(zhǔn)的檢測技術(shù)（畢竟標(biāo)準(zhǔn)的變革不宜那么頻繁！！！要加把勁了，跟上新技術(shù)。）

2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光染料或者熒光基團(tuán)，在整個(gè)PCR過程中通過收集熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測每一個(gè)循環(huán)中擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和CT值對待測樣品進(jìn)行定量分析。qPCR常用的有兩種方法：SYBR Green法和TaqMan探針法。

①熒光染料法（SYBR Green）：SYBR Green Ⅰ是熒光定量PCR中最常用的熒光染料，它能與所有的雙鏈DNA結(jié)合。在PCR反應(yīng)體系中，加入SYBR Green Ⅰ，它就會(huì)在過程中與雙鏈DNA結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。因此，反應(yīng)中發(fā)出的全部熒光信號(hào)就會(huì)與反應(yīng)中雙鏈DNA的量呈正比，熒光強(qiáng)度也會(huì)隨著產(chǎn)物的增加而增加。但是由于染料與雙鏈DNA是非特異性結(jié)合，如果反應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增或引物二聚體的產(chǎn)生，也將同時(shí)被檢測，從而可能導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，因此可能產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。

優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格相對較低；使用方便；檢測靈敏度高。

缺點(diǎn)：檢測特異性較低，可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果；無法進(jìn)行多重PCR檢測。

圖2 熒光染料法的工作原理

②熒光探針法（TaqMan技術(shù)）：TaqMan探針是最早用于定量的方法，也是臨床檢測中最常用的檢測方法。PCR擴(kuò)增時(shí)，加入一對引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針。該探針是一個(gè)寡核苷酸，5'端標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)（Reporter, R），3'端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)（Quencher, Q）。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，以至于無法檢測到熒光信號(hào)；而當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)（在延伸階段），探針會(huì)被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解，使報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射底的熒光不會(huì)再被吸收，從而可以在熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA，就形成一個(gè)熒光分子，PCR產(chǎn)物的形成與熒光分子的形成完全同步，PCR產(chǎn)物越多，熒光信號(hào)累積的越多，熒光強(qiáng)度越大。

優(yōu)點(diǎn)：檢測特異性強(qiáng)；靈敏度高；適合進(jìn)行多重qPCR檢測。

缺點(diǎn)：需要根據(jù)不同的模板序列，合成不同的探針；靶序列濃度極低或存在大量非特異性擴(kuò)增時(shí)，無法準(zhǔn)確定量。

圖3 熒光探針法的工作原理

3. 逆轉(zhuǎn)錄PCR（ Reverse T ranscription - PCR , RT - PCR）

逆轉(zhuǎn)錄PCR也叫反轉(zhuǎn)錄PCR，將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增相結(jié)合，是PCR的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶將一條單鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。RT-PCR技術(shù)靈敏且應(yīng)用廣泛，可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。一般通過一步法或兩步法進(jìn)行，一步法是RT反應(yīng)和PCR反應(yīng)在同一試管中進(jìn)行；而在兩步法中兩個(gè)反應(yīng)是分開依次進(jìn)行的。

4.實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（Real-time RT-PCR, RT-qPCR）

Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的組合，其中的“RT”是Reverse transcription（逆轉(zhuǎn)錄）的意思，所以RT-qPCR就是結(jié)合了熒光定量技術(shù)的逆轉(zhuǎn)錄PCR，即以mRNA或總RNA為模板，先反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以cDNA為模板，通過熒光定量PCR進(jìn)行定量檢測分析。因?yàn)镽T-PCR只可以定性，但不能進(jìn)行定量分析。與RT-PCR一樣，RT-qPCR定量分析RNA也有兩種方法：一步法和兩步法。兩種方法都需要先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再將其作為qPCR擴(kuò)增的模板，只是一步法中的RT和qPCR在同一試管中進(jìn)行，兩步法中的RT和qPCR是按順序分開進(jìn)行。

圖4 RT-qPCR的一步法和兩步法

5.數(shù)字PCR（Digital PCR, Dig-PCR, dPCR）

數(shù)字PCR被稱為第三代PCR技術(shù)，它是一種核酸分子絕對定量（直接定量更準(zhǔn)確一些?。。?/strong>技術(shù)。相較于qPCR，數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù)，是對起始樣品的絕對定量，可針對核酸分子做更精確的定量分析。其創(chuàng)新之處在于， PCR反應(yīng)體系經(jīng)過微滴制備可將目標(biāo)分子DNA或RNA樣品分割至數(shù)千到數(shù)萬個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)單元中，然后對眾多微反應(yīng)單元內(nèi)的靶序列進(jìn)行單分子模板 PCR 擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)”單分子模板PCR擴(kuò)增”。擴(kuò)增結(jié)束后含有目標(biāo)分子模板的單元會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)，最終根據(jù)泊松分布原理以及陽性微滴的比例，分析軟件可計(jì)算給出目的分子的濃度或拷貝數(shù)。目前的數(shù)字PCR技術(shù)在病原體篩查、NIPT檢測、腫瘤突變檢測等方向已得到廣泛應(yīng)用。

相較于第一代普通PCR和第二代qPCR，數(shù)字PCR具有以下優(yōu)勢：

優(yōu)點(diǎn)：無需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可對目標(biāo)分子進(jìn)行絕對（凡事無絕對，直接更準(zhǔn)確）定量；測試結(jié)果可直接給出樣本具體的濃度/拷貝數(shù)，而非CT值；（抑制劑）耐受性強(qiáng)，通過把模板分散到各個(gè)反應(yīng)微單元，能夠有效降低抑制劑對擴(kuò)增的影響，可以實(shí)現(xiàn)單分子PCR擴(kuò)增，非常利于復(fù)雜樣本和突變樣本的檢測，具有比傳統(tǒng)熒光定量 PCR 更加出色的靈敏度和精確性；可通過熒光編解碼實(shí)現(xiàn)多重/超多重PCR檢測。有個(gè)超多重?cái)?shù)字PCR培訓(xùn)班干貨滿滿，可以去蹭課哦！鏈接：

缺點(diǎn)：需要根據(jù)不同的模板序列，合成不同的探針；成本相對較高。

圖4 dPCR的工作原理

綜上所述，PCR技術(shù)被浪出來之后，經(jīng)歷了凝膠電泳技術(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)和數(shù)字PCR（dPCR）技術(shù)，其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)發(fā)展相對成熟，數(shù)字PCR技術(shù)還在不斷地發(fā)展中。當(dāng)然，除了上述名詞之外，還有不對稱PCR，Touchdown PCR，ARMS PCR，巢氏PCR等諸多概念，想要了解地更清楚，不想做幕后的小白一樣傻傻的分不清，還需要不斷地學(xué)習(xí)才行。古德拜！