導(dǎo)讀

“自噬”是細(xì)胞的一個(gè)自我消化的過(guò)程，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，自噬就像是細(xì)胞內(nèi)的“清潔工”，負(fù)責(zé)清理不再需要或功能異常的“垃圾”。

日本學(xué)者大隅良典是這一領(lǐng)域的先驅(qū)，憑借自噬相關(guān)的研究，他斬獲了2016年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

出生在日本的大隅良典從小就對(duì)化學(xué)頗感興趣，20世紀(jì)90年代，大隅良典從面包酵母中找到了與自噬有關(guān)的關(guān)鍵基因，自那以后，他開(kāi)啟了自噬研究之路，并將這項(xiàng)研究帶到了人類(lèi)細(xì)胞之中。

以下是大隅良典的自述。

大隅良典 | 撰文

周 晨 | 翻譯

01

早年經(jīng)歷與影響

1945年，也就是第二次世界大戰(zhàn)結(jié)束前半年，我出生在日本福岡。我的父親叫大雄，是九州大學(xué)采礦工程教授；母親叫詩(shī)名。

當(dāng)時(shí)，日本普遍貧窮，甚至經(jīng)常食不果腹。我是一個(gè)體弱多病的孩子，再加上營(yíng)養(yǎng)不良導(dǎo)致身體更為孱弱。我出生后，母親患上了肺結(jié)核，在床上與病魔抗?fàn)幜撕荛L(zhǎng)時(shí)間。我仍然記得她患上脊柱結(jié)核后打石膏的樣子。

幸運(yùn)的是，那時(shí)夏威夷的一位友人向我父母寄來(lái)了新研發(fā)的抗生素，正是這及時(shí)的援助讓我的母親得以康復(fù)。雖然當(dāng)時(shí)的我對(duì)這些藥物的具體意義并不完全理解，但“鏈霉素”、“青霉素”等名詞卻在我心中留下了深深的烙印。大約在我8歲那年，母親終于能夠重拾正常的生活。與此同時(shí)，比我大12歲的哥哥大助順利考入東京大學(xué)文學(xué)系，他在我上小學(xué)時(shí)已經(jīng)是個(gè)大學(xué)生了。在父親、兩位姐姐禮子和文子，以及眾多親友的支持下，我順利度過(guò)了那段充滿挑戰(zhàn)的日子。 倘若那時(shí)我能遇到一位出類(lèi)拔萃的醫(yī)生，或許我會(huì)走上醫(yī)學(xué)的道路。然而，我心中始終燃燒著成為科學(xué)家的夢(mèng)想，這夢(mèng)想在父母的期望中得到了鼓舞。

我在一個(gè)充滿自然氣息的環(huán)境中成長(zhǎng)，我的家四周環(huán)繞著稻田、溪流、山丘和大海。我的童年時(shí)光大多在戶外度過(guò)，捕捉魚(yú)類(lèi)、采摘野果。在小學(xué)期間，我對(duì)昆蟲(chóng)的收集產(chǎn)生了濃厚的興趣，花費(fèi)大量的時(shí)間去尋找各種奇特的昆蟲(chóng)標(biāo)本。夜晚，我會(huì)仰望星空，嘗試記住每一顆星星和星座的名字。然而，這些興趣并未得到專(zhuān)業(yè)的培養(yǎng)，最終只成為了我童年時(shí)期的美好回憶，而非終身熱愛(ài)的追求。每當(dāng)哥哥從東京大學(xué)放假回家，他總會(huì)帶回一些書(shū)籍，其中不乏精心挑選的科學(xué)類(lèi)讀物。這些書(shū)籍大大拓寬了我對(duì)學(xué)校之外世界的認(rèn)知。盡管我體質(zhì)較弱，既無(wú)運(yùn)動(dòng)天賦，也不擅長(zhǎng)文學(xué)，但我仍然努力在學(xué)校取得優(yōu)異的成績(jī)。

圖1. 1951年在福岡拍攝的全家福（父母、哥哥和兩個(gè)姐姐）。

在高中期間，我加入了化學(xué)俱樂(lè)部，我們會(huì)在其中混合各種化學(xué)物質(zhì)，并喜歡觀察它們之間的反應(yīng)。我清楚地記得瓊脂中“列桑格現(xiàn)象”（Liesegang phenomenon）的美，但當(dāng)時(shí)我并不知道如何分析它。由于我希望成為一名化學(xué)家，因此選擇了以化學(xué)見(jiàn)長(zhǎng)的東京大學(xué)就讀。

然而，化學(xué)課程卻并沒(méi)有激發(fā)我的興趣，我經(jīng)歷了一段不確定的時(shí)期，甚至為我的未來(lái)感到苦惱。幸運(yùn)的是，當(dāng)時(shí)分子生物學(xué)領(lǐng)域剛剛興起，于是我決定專(zhuān)攻這一領(lǐng)域。 本科畢業(yè)后我加入了今堀和男（Kazutomo Imahori）的實(shí)驗(yàn)室，他是當(dāng)時(shí)日本少數(shù)幾個(gè)擁有分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家之一。

今堀和男的研究領(lǐng)域是物理化學(xué)，用于評(píng)估蛋白質(zhì)與核酸之間的相互作用。在前田昭（Akio Maeda）的指導(dǎo)下，我開(kāi)始研究核糖體亞基在蛋白質(zhì)合成中的作用。盡管我無(wú)法得出特別有趣的結(jié)果，但我在今堀實(shí)驗(yàn)室的時(shí)光令人興奮，因?yàn)槲覀儏⑴c了快速發(fā)展領(lǐng)域的工作，我第一次體驗(yàn)到了實(shí)驗(yàn)工作的樂(lè)趣。這段經(jīng)歷還讓我對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的連續(xù)性有了深刻的認(rèn)識(shí)。

圖2. 1967年高中化學(xué)俱樂(lè)部。

在我研究生學(xué)習(xí)期間，大學(xué)學(xué)生抗議活動(dòng)非常多，而東京大學(xué)在這一時(shí)期正處于社會(huì)辯論和社會(huì)變革的中心。我在這段時(shí)間里意識(shí)到，我們必須關(guān)注社會(huì)發(fā)展和社會(huì)的方向，為了參加討論和示威活動(dòng)，我也因此無(wú)法完全專(zhuān)注于實(shí)驗(yàn)室工作。

從攻讀博士學(xué)位第二年開(kāi)始，我決定轉(zhuǎn)到京都大學(xué)，前田昭此時(shí)已經(jīng)是副教授，他加入了新成立的生物物理系。京都大學(xué)提供了一個(gè)非常自由的環(huán)境，我在化學(xué)系生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室中遇到了一群才華橫溢的新學(xué)生和朋友。在研究過(guò)程中，我對(duì)大腸桿菌素E3產(chǎn)生了興趣，它能夠穿過(guò)細(xì)菌細(xì)胞膜并立即抑制蛋白質(zhì)合成。這一時(shí)期，我對(duì)生物膜的興趣不斷增長(zhǎng)。

一年后的1971年，我與中澤麻里子（Mariko Nakazawa）結(jié)婚，她在我之后兩年加入了今堀實(shí)驗(yàn)室。我們結(jié)婚后在京都度過(guò)了非常令人難忘的一年。然而不久后，中澤麻里子意外地懷孕了，她也因此返回了東京。為了支持我們的新家庭，她成功申請(qǐng)加入了新成立的三菱生命科學(xué)研究所。我也回到東京，選擇跟隨今堀和男，此時(shí)他已經(jīng)轉(zhuǎn)到了東京大學(xué)的農(nóng)學(xué)院，我在那之后勉強(qiáng)完成了論文，獲得了博士學(xué)位。

圖3.（a）今堀和男和（b）安良浩二。

當(dāng)時(shí)，要獲得一個(gè)良好的學(xué)術(shù)職位并不容易。 由于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域剛剛開(kāi)始興起，今堀和男建議我前往洛克菲勒大學(xué)的G. M. 埃德?tīng)柭℅. M. Edelman）實(shí)驗(yàn)室工作。 當(dāng)時(shí)，今堀和男以前的學(xué)生伊原一朗（Ichiro Yahara）在那里表現(xiàn)很好，也因此我很快就獲得了一個(gè)崗位。這是我第一次離開(kāi)日本，而且與我之前的工作領(lǐng)域大不相同，所以我一度非常迷茫。我的妻子在獲知后決定離開(kāi)研究所，和我一起去紐約。幸運(yùn)的是，中澤麻里子很快在同一所大學(xué)的諾頓·辛德（Norton Zinder）實(shí)驗(yàn)室找到了一個(gè)研究職位。

最初，我研究的是淋巴細(xì)胞的絲裂原，但埃德?tīng)柭鼪Q定將實(shí)驗(yàn)室的重點(diǎn)轉(zhuǎn)向小鼠發(fā)育，于是我參與了建立體外小鼠受精系統(tǒng)的工作。 我之前只處理過(guò)大腸桿菌，因此我每天都會(huì)為如何用少量卵子捕捉早期發(fā)育過(guò)程而苦惱。不久之后，邁克·賈茲溫斯基（Mike Jazwinski）從亞瑟·科爾伯格（Arthur Kornberg）的實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)到我們的實(shí)驗(yàn)室。受哈特韋爾（Hartwell）發(fā)現(xiàn)cdc突變體的啟發(fā)，我們開(kāi)始了一個(gè)項(xiàng)目，旨在揭示酵母中DNA復(fù)制起始的機(jī)制，我加入了這個(gè)項(xiàng)目。我們?cè)?jì)劃使用密度梯度離心法在這個(gè)項(xiàng)目中使用分離的細(xì)胞核，但很難獲得未受損的細(xì)胞核。我注意到試管頂部有一層白色物質(zhì)，當(dāng)我出于好奇在顯微鏡下觀察這層物質(zhì)時(shí)，我意識(shí)到我們還在分離高度純化的液泡。這給我留下了深刻的印象，并是我走向今天這個(gè)位置的眾多偶然環(huán)節(jié)之一。

圖4. 大隅良典和中澤麻里子于1971年和2015年。

1977年秋天，東京大學(xué)理學(xué)院的安良浩二（Yasuhiro Anraku）教授邀請(qǐng)我回到日本擔(dān)任他的實(shí)驗(yàn)室的助理教授，盡管我剛開(kāi)始研究酵母DNA復(fù)制起始的工作，但還是決定盡快回到日本。1977年12月，我?guī)е?dāng)時(shí)即將滿6歲的兒子回到了日本，而中澤麻里子則和我們?cè)诩~約剛出生的第二個(gè)兒子一起多待了幾個(gè)月，以完成她在辛德實(shí)驗(yàn)室的工作。

安良浩二實(shí)驗(yàn)室以其在E. coli中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和呼吸機(jī)制方面的工作而聞名，但安良浩二允許我開(kāi)始一個(gè)關(guān)于酵母的項(xiàng)目。回想起來(lái)，我真的很感激安良浩二給我的這個(gè)機(jī)會(huì)。

我最終決定不去研究質(zhì)膜，而是液泡的膜，這是一種細(xì)胞器。當(dāng)時(shí)，液泡被認(rèn)為是細(xì)胞的“垃圾場(chǎng)”，因此很少有科學(xué)家對(duì)它感興趣，但我在植物學(xué)系的位置以及毗鄰馬益澤正志（Masashi Tazawa）實(shí)驗(yàn)室的位置使我相信液泡是一個(gè)被低估的、迷人的細(xì)胞器。我相信許多酵母研究人員都認(rèn)為這是一個(gè)奇怪的項(xiàng)目選擇。

很快，我開(kāi)發(fā)了一種從高度純化的液泡中分離液泡膜囊泡的程序。雖然液泡占細(xì)胞體積的大約四分之一，但我只能獲得少量液泡膜，但這足以證明液泡膜上氨基酸和鈣的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，我們是第一個(gè)展示新型質(zhì)子泵V型ATP酶的團(tuán)隊(duì)，它為液泡轉(zhuǎn)運(yùn)提供了驅(qū)動(dòng)力，這些工作是與已故的嘉數(shù)嘉美和日本田內(nèi)悅子合作的成果。此后，V型ATP酶的結(jié)構(gòu)和功能研究成為了一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域，一直持續(xù)到今天。

02

搬到小田原并發(fā)現(xiàn)自噬

在對(duì)液泡膜進(jìn)行了10年的研究之后，我獲得了東京大學(xué)文理學(xué)院（小田原校區(qū)）的副教授職位，并建立了自己的實(shí)驗(yàn)室——只有我一個(gè)人。

我的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備非常簡(jiǎn)陋，只有一臺(tái)搖床、一個(gè)培養(yǎng)箱、一個(gè)分光光度計(jì)、一臺(tái)基礎(chǔ)光學(xué)顯微鏡和幾個(gè)其他儀器。我意識(shí)到這是一個(gè)開(kāi)始全新課題的難得機(jī)會(huì)，于是在我們部門(mén)的第一次會(huì)議上宣布我將研究液泡的溶解功能。然而，我并沒(méi)有精心策劃的策略來(lái)研究這個(gè)問(wèn)題。

由于液泡是一個(gè)包含多種溶解酶的酸性區(qū)室，我推測(cè)這個(gè)細(xì)胞器將發(fā)揮與哺乳動(dòng)物溶酶體類(lèi)似的作用。將可能有害的降解過(guò)程隔離在膜區(qū)室中是有生物學(xué)意義的，但當(dāng)時(shí)我知道，如果這是真的，那么需要降解的物質(zhì)必須穿過(guò)液泡膜，這表明這需要細(xì)胞生物學(xué)的方法，并不容易解決。那時(shí)候，我關(guān)于蛋白質(zhì)降解的研究源于對(duì)液泡的研究，那一年我43歲。

圖5. 東京大學(xué)實(shí)驗(yàn)室的首批成員

溶酶體是克里斯蒂安·德迪夫（Christian de Duve）于1955年發(fā)現(xiàn)的，不久后，洛克菲勒大學(xué)的研究人員通過(guò)電子顯微鏡觀察到溶酶體接收來(lái)自細(xì)胞外和細(xì)胞質(zhì)的物質(zhì)。德迪夫用希臘語(yǔ)“self-eating”一詞來(lái)描述這種現(xiàn)象，意為“自我吞噬”。雖然像格倫·莫蒂莫爾（Glenn Mortimore）和佩爾·塞格倫（Per Seglen），對(duì)自噬的調(diào)節(jié)和復(fù)雜的膜動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了深入的分析，但當(dāng)我加入這一領(lǐng)域時(shí)，問(wèn)題比答案多得多。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中溶酶體和膜動(dòng)力學(xué)的復(fù)雜性阻礙了自噬機(jī)制的揭示。德迪夫的實(shí)驗(yàn)室與埃德?tīng)柭膶?shí)驗(yàn)室在同一座大樓里，雖然我有來(lái)自他實(shí)驗(yàn)室的朋友，但我從未有機(jī)會(huì)在洛克菲勒大學(xué)與這位偉大的科學(xué)家見(jiàn)面。

今天的光學(xué)顯微鏡，包括熒光顯微鏡，都是先進(jìn)的儀器，但在那個(gè)時(shí)代，光學(xué)顯微鏡的功率有限，很難獲得關(guān)于細(xì)胞內(nèi)的信息，特別是在對(duì)于微小的酵母細(xì)胞研究的時(shí)候。然而，可以在相差顯微鏡下清晰地觀察到酵母液泡。液泡內(nèi)部有點(diǎn)像低蛋白濃度的鹽溶液，因此我知道由于折射率的不同，很容易檢測(cè)到液泡內(nèi)的結(jié)構(gòu)。之后我每天都會(huì)在顯微鏡下觀察液泡，我想我可能在這些年里比任何人都更長(zhǎng)時(shí)間地觀察酵母細(xì)胞！

首先，我尋找了一種條件，使酵母能夠分解自己的蛋白質(zhì)，并確定了孢子形成是最佳候選。 這種從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)細(xì)胞到通過(guò)減數(shù)分裂產(chǎn)生四個(gè)孢子的戲劇性變化是由氮的環(huán)境耗竭引起的。由于氮是蛋白質(zhì)的主要成分，我推測(cè)這種劇烈的細(xì)胞重塑所需的蛋白質(zhì)合成必須依賴于細(xì)胞自身蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)。因此，我密切觀察了孢子形成過(guò)程中的液泡形態(tài)，但沒(méi)有觀察到任何明顯的變化。

有一天，我突然設(shè)想，如果我使用一種缺乏液泡蛋白酶的細(xì)胞，那么被輸送到液泡中進(jìn)行降解的結(jié)構(gòu)將保留在這個(gè)細(xì)胞器中，并可能可見(jiàn)。幸運(yùn)的是，伊麗莎白·瓊斯（Elizabeth Jones）已經(jīng)構(gòu)建了缺乏液泡蛋白酶的菌株，并且作為酵母社區(qū)共享精神的典范，將它們存放在了加州大學(xué)伯克利分校的酵母遺傳種質(zhì)中心，因此我立即請(qǐng)求將它們送到我的實(shí)驗(yàn)室。當(dāng)它們到達(dá)時(shí)，我使它們處于氮饑餓狀態(tài)并在顯微鏡下觀察。我觀察到液泡內(nèi)有小的球形結(jié)構(gòu)在劇烈移動(dòng)。這些結(jié)構(gòu)在氮饑餓開(kāi)始后30分鐘內(nèi)出現(xiàn)，并在幾小時(shí)內(nèi)完全填充了液泡。在這個(gè)原本平靜的酵母細(xì)胞中，這種明顯的表型真的打動(dòng)了我，我清晰地記得盯著顯微鏡看了好幾個(gè)小時(shí)，甚至于無(wú)法移開(kāi)視線。這些結(jié)構(gòu)在野生型細(xì)胞中會(huì)立即降解，這就是為什么它們從未被正確記錄的原因。

我很幸運(yùn)有兩個(gè)原因： 首先，液泡內(nèi)的結(jié)構(gòu)，我們現(xiàn)在稱之為自噬體，足夠大，可以在顯微鏡下看到；

其次，自噬體通過(guò)布朗運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的強(qiáng)烈運(yùn)動(dòng)使得它們?cè)谝号葜械姆e累很容易被注意到，即使使用基礎(chǔ)光學(xué)顯微鏡也是如此。 這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)決定了我職業(yè)生涯的剩余部分。

我決定立即通過(guò)電子顯微鏡確定這一現(xiàn)象的原因，并尋求了美壽巴（Misuzu Baba）以及大須美佐子（Masako Osumi）的幫助。他們拍攝的圖像美得令人驚嘆，為酵母自噬的特征性膜現(xiàn)象提供了確鑿的證據(jù)。這些圖像顯示，自噬體與細(xì)胞質(zhì)具有相同的核糖體密度，以及各種細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器，這表明自噬是一個(gè)非選擇性的降解過(guò)程。這些實(shí)驗(yàn)為我們提供了當(dāng)前對(duì)與自噬相關(guān)的膜動(dòng)力學(xué)的理解。雖然液泡比哺乳動(dòng)物的溶酶體大得多，但我們觀察到的整個(gè)過(guò)程在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的巨自噬相同，證實(shí)了酵母可以作為研究自噬的模式生物。

酵母作為模式生物最吸引人的特點(diǎn)是其遺傳可操作性，這使它在解析復(fù)雜的生物現(xiàn)象方面具有巨大的優(yōu)勢(shì)。對(duì)我影響很大的兩個(gè)重要例子是李·哈特韋爾（Lee Hartwell）的cdc突變體鑒定及其在細(xì)胞周期中的作用，以及蘭迪·謝克曼的sec突變體分離及其在膜轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用。

由于我們對(duì)參與自噬的基因和蛋白質(zhì)一無(wú)所知，因此第一步是分離出自噬缺陷突變體。但是當(dāng)時(shí)，我們監(jiān)測(cè)自噬的唯一方法就是觀察液泡內(nèi)自噬體的積累。我第一位碩士生塚田美紀(jì)（Miki Tsukada）在我們工作的這個(gè)階段發(fā)揮了核心作用。她取出了數(shù)千個(gè)誘變細(xì)胞，分別使它們處于饑餓狀態(tài)，然后檢查液泡內(nèi)是否存在缺少自噬體的突變體。這種方法使我們發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)自噬突變菌株，我們將其命名為apg1。在這個(gè)菌株中無(wú)法誘導(dǎo)蛋白質(zhì)降解，這使我們確信自噬體確實(shí)是饑餓期間負(fù)責(zé)降解的。正如我們所預(yù)料的，我們還發(fā)現(xiàn)，純合二倍體突變體不能產(chǎn)生孢子。然而，在營(yíng)養(yǎng)豐富的條件下，apg1菌株與野生型細(xì)胞之間并沒(méi)有觀察到差異，液泡功能或分泌也沒(méi)有明顯的缺陷。

很快我們就發(fā)現(xiàn)，與野生型細(xì)胞相比，apg1細(xì)胞在氮饑餓期間迅速失去活力。我們假設(shè)這一表型是由自噬缺陷引起的，因此我們接下來(lái)進(jìn)行了一項(xiàng)初步的活力評(píng)估篩選。通過(guò)分離活力降低的菌株，然后檢查這些菌株在自噬方面的形態(tài)缺陷，我們能夠在一次篩選中鑒定出大約100個(gè)自噬缺陷菌株。進(jìn)一步的遺傳分析表明，這些菌株中有14個(gè)是互補(bǔ)組。根據(jù)我們目前對(duì)自噬的理解，這一篩選非常有效。我們最初預(yù)測(cè)這些突變體將在自噬過(guò)程的不同階段表現(xiàn)出缺陷，但令人驚訝的是，它們都對(duì)自噬體的形成至關(guān)重要，這是自噬過(guò)程中最重要的一步。

接下來(lái)，我們著手克隆并鑒定篩選中觀察到的突變表型所涉及的基因。塚田首先成功克隆了APG1基因，這使我們了解到該基因編碼一種蛋白激酶。然而，我們還發(fā)現(xiàn)，剩余的基因編碼對(duì)自噬至關(guān)重要的未表征蛋白質(zhì)，但在營(yíng)養(yǎng)豐富條件下對(duì)生長(zhǎng)不是必需的。因此，我們無(wú)法推斷出它們的功能，并經(jīng)歷了一段無(wú)法發(fā)表我們激動(dòng)人心的發(fā)現(xiàn)的困難時(shí)期。盡管我們?nèi)〉昧丝焖俚倪M(jìn)展，但自噬基因仍然逃脫了全世界酵母遺傳綜合分析中其他研究人員的關(guān)注。我懷疑這是因?yàn)檠芯咳藛T對(duì)必需基因感興趣，這些基因通常被定義為在營(yíng)養(yǎng)豐富培養(yǎng)基中無(wú)法存活的基因。此時(shí)，武田信司也開(kāi)發(fā)了一種自噬活性的定量測(cè)定方法，即至今仍廣泛使用的Pho8Li60測(cè)定法。這些發(fā)展共同為我們后續(xù)的自噬分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

這就是我在東京大學(xué)那個(gè)小實(shí)驗(yàn)室里開(kāi)始自噬研究的經(jīng)歷。從發(fā)現(xiàn)自噬到開(kāi)始表征Atg基因，整個(gè)過(guò)程在八年內(nèi)在駒場(chǎng)（日本東京都目黑區(qū)的一個(gè)町）完成。

03

國(guó)家基礎(chǔ)生物學(xué)研究所

下一個(gè)階段開(kāi)始于1996年。

當(dāng)時(shí)我被選為位于岡崎的國(guó)家基礎(chǔ)生物學(xué)研究所（NIBB）的教授。該機(jī)構(gòu)為基礎(chǔ)生物學(xué)提供了非常有利的環(huán)境，我選擇了三名研究人員加入我們的團(tuán)隊(duì)：來(lái)自關(guān)西醫(yī)學(xué)院的吉本大蔵（Tamotsu Yoshimori），他在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中整合我們?cè)诮湍钢械陌l(fā)現(xiàn)；野田武司（Takeshi Noda），他是我們?cè)隈x場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室的第一個(gè)博士生；以及在美國(guó)約翰·霍普金斯大學(xué)學(xué)習(xí)過(guò)的河村良明（Yoshiaki Kamada）。第二年，前東京醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)生水島伸（Noboru Mizushima）也加入實(shí)驗(yàn)室，成為日本學(xué)術(shù)振興會(huì)（JSPS）的博士后研究員，后來(lái)成為助理教授。從那時(shí)起，來(lái)自日本各地的研究生和博士后加入了我們的實(shí)驗(yàn)室，我們進(jìn)入了研究的最富有成果的時(shí)期。在NIBB，我們能夠創(chuàng)造出一個(gè)真正獨(dú)特的研究環(huán)境，將我們的工作擴(kuò)展到包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞，這對(duì)該領(lǐng)域的發(fā)展非常重要。我們實(shí)驗(yàn)室的大多數(shù)成員都住在NIBB附近，由于吉本大蔵和我在這段時(shí)間都在外工作，我們經(jīng)常工作到深夜，邊喝啤酒邊討論科學(xué)。

我原本預(yù)計(jì)分離自噬所需的所有基因?qū)⑿枰荛L(zhǎng)時(shí)間，但感謝我妻子實(shí)驗(yàn)室的合作，該實(shí)驗(yàn)室在東京理科大學(xué)幫助我們進(jìn)行克隆，以及1996年對(duì)整個(gè)酵母基因組的測(cè)序，我們能夠在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)闡明幾乎所有APG基因的遺傳背景。

圖6. 2003年國(guó)家基礎(chǔ)生物學(xué)研究所的大隅實(shí)驗(yàn)室。

之后，我們著手鑒定已表征的Apg蛋白的相互作用蛋白，并能夠在氮饑餓條件下自信地鑒定出對(duì)自噬至關(guān)重要的所有18個(gè)基因。由邁克爾·圖姆（Michael Thumm）領(lǐng)導(dǎo)的一個(gè)團(tuán)隊(duì)正在研究在饑餓條件下使用抗體降低蛋白質(zhì)水平，并緊跟在我們團(tuán)隊(duì)之后，使用“aut”別名命名他們發(fā)現(xiàn)的基因。與此同時(shí)，丹·克利翁斯基（Dan Klionsky）的團(tuán)隊(duì)正在研究氨基肽酶Ape1從細(xì)胞質(zhì)到液泡靶向的傳遞，現(xiàn)在被稱為Cvt途徑，他們使用“cvt”別名來(lái)識(shí)別基因。該途徑實(shí)際上是負(fù)責(zé)Ape1成熟的生物合成途徑。通過(guò)我們團(tuán)隊(duì)的協(xié)作，我們確定這一過(guò)程是通過(guò)類(lèi)似膜的現(xiàn)象發(fā)生的，這些現(xiàn)象依賴于核心自噬機(jī)制和非常有選擇性地隔離Ape1以傳遞到液泡。因此，克利翁斯基的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了Cvt途徑，這成為選擇性自噬這一主要領(lǐng)域的重要模型。

隨著多個(gè)團(tuán)隊(duì)在酵母中繼續(xù)分離出具有自噬缺陷的突變菌株，我們集體決定在ATG別名下統(tǒng)一基因名稱，以簡(jiǎn)化該領(lǐng)域的命名。由于我們團(tuán)隊(duì)鑒定了大多數(shù)關(guān)鍵的自噬相關(guān)基因，因此在我們團(tuán)隊(duì)為APG基因命名時(shí)使用的基因編號(hào)在這一系統(tǒng)中得到了保留。隨著進(jìn)一步鑒定自噬相關(guān)基因，其中大多數(shù)涉及選擇性自噬，ATG基因的數(shù)量現(xiàn)已達(dá)到41個(gè)。

在我們?cè)贜IBB任職期間，隨著我們開(kāi)始研究ATG基因產(chǎn)物以深入了解其功能，重要的發(fā)現(xiàn)接踵而至。水島伸在他的研究中取得了第一個(gè)重要突破，研究對(duì)象是最近克隆的Atg12蛋白。他發(fā)現(xiàn)了一個(gè)復(fù)雜的共軛系統(tǒng)，它以泛素樣的方式起作用，產(chǎn)生Atg12-Atg5-Atg16復(fù)合物二聚體，這對(duì)自噬至關(guān)重要。另外兩名研究生，高義切里佐（Takayoshi Kirisako）和一村吉信（Yoshinobu Ichimura），也發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)泛素樣共軛系統(tǒng)，該系統(tǒng)不同尋常地導(dǎo)致Atg8與膜磷脂磷脂酰乙醇胺結(jié)合。Atg8的同源物很快被吉本大蔵在哺乳動(dòng)物中和我們的團(tuán)隊(duì)在植物中鑒定出來(lái)，它在整個(gè)自噬過(guò)程中的所有階段都與自噬體相關(guān)，因此被廣泛用作自噬進(jìn)展的標(biāo)記。因此，我們了解到近一半的必需Atg蛋白僅參與兩個(gè)共軛反應(yīng)。這些反應(yīng)所涉及的復(fù)合物的重要結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)得益于我們與稻垣冬彥（Fuyuhiko Inagaki）和野田伸生（Nobuo Noda）的團(tuán)隊(duì)之間的緊密合作而得以解決。

隨著自噬特異性PI3激酶復(fù)合物的鑒定，我們將其命名為PI3激酶復(fù)合物I，從而獲得了更多詳細(xì)信息。木原明生（Akio Kihara）的研究表明，Atg6實(shí)際上只是斯科特·埃姆爾（Scott Emr）的團(tuán)隊(duì)最近鑒定出的Vps30蛋白，即液泡蛋白分選途徑中的蛋白。Vps30是PI3激酶復(fù)合物的一個(gè)組成部分，我們隨后發(fā)現(xiàn)Atg14使該復(fù)合物在自噬中發(fā)揮了特定作用。PI3激酶復(fù)合物I的另一個(gè)特定成分Atg38最近被荒木康弘（Yasuhiro Araki）發(fā)現(xiàn)。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)了Atg13在激活A(yù)tg1激酶功能方面的重要作用，并確定了Atg17、Atg29和Atg31是形成自噬誘導(dǎo)所必需的復(fù)合物，這在饑餓條件下尤為重要。隨著我們對(duì)Atg9、Atg18和Atg2的研究，我們很快將饑餓條件下對(duì)自噬至關(guān)重要的所有18個(gè)基因分為六個(gè)功能組。鈴木久仁里（Kuninori Suzuki）進(jìn)一步探索了這一點(diǎn)，他使用熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)了前自噬體結(jié)構(gòu)（PAS），這是一種動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，所有Atg蛋白至少部分組裝于此，并精細(xì)協(xié)調(diào)自噬體的形成。鈴木久仁里的工作還表明，Atg蛋白以分層的方式與PAS結(jié)合，以在自噬中發(fā)揮其重要作用，這進(jìn)一步揭示了自噬的機(jī)制。

ATG基因的鑒定徹底改變了自噬研究。其中一個(gè)重要例子是水島伸使用帶有GFP標(biāo)記的LC3轉(zhuǎn)基因小鼠展示哺乳動(dòng)物中自噬的進(jìn)展，以及他成功生成了首個(gè)Atg5自噬敲除小鼠。加上小松正明（Masaaki Komatsu）在小鼠中敲除Atg7的研究，這些研究改變了我們對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中自噬的理解，并推動(dòng)了世界各地對(duì)各種細(xì)胞、組織、器官和整個(gè)生物體中ATG基因的廣泛遺傳操作。這一運(yùn)動(dòng)有助于揭示自噬的多種生理功能。其中，自噬的回收功能是細(xì)胞中最基本的，有助于應(yīng)對(duì)常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)限制挑戰(zhàn)。但自噬不僅對(duì)營(yíng)養(yǎng)回收很重要：它還涉及經(jīng)常選擇性地清除不必要的或有害的細(xì)胞內(nèi)成分，這對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境非常重要。最近，蛋白質(zhì)、超分子結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器的選擇性消除已成為核心自噬機(jī)制在生理上重要的應(yīng)用。其中特別突出的一個(gè)例子是備受關(guān)注的選擇性線粒體自噬或線粒體自噬領(lǐng)域。通過(guò)自噬清除老化和可能受損的線粒體可確保高效的能量產(chǎn)生和健康的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，這強(qiáng)調(diào)了自噬與細(xì)胞的精細(xì)整合。

04

在東京工業(yè)大學(xué)我最后一個(gè)實(shí)驗(yàn)室

即使在像酵母細(xì)胞這樣看似簡(jiǎn)單的生物體中，仍有許多謎團(tuán)尚未解開(kāi)。因此，自從吉本大蔵和水島伸成立自己的研究小組以來(lái)，我的實(shí)驗(yàn)室一直專(zhuān)注于酵母研究，已有13年之久。

2009年，我的職業(yè)生涯又發(fā)生了另一個(gè)重要變化。東京工業(yè)大學(xué)向我提供了一個(gè)擁有先進(jìn)設(shè)施的特聘教授職位，于是我決定返回東京地區(qū)。與小林仁志（Hitoshi Nakatogawa）和鈴木教授擔(dān)任助理教授，以及后來(lái)的山下早苗（Hayashi Yamomoto），我們成立了一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)室。我?guī)Я撕芏鄟?lái)自岡崎的同事到這個(gè)新設(shè)施。我們專(zhuān)注于一個(gè)主題，即通過(guò)Atg蛋白的功能分析，研究自噬體的形成過(guò)程。最近，我們發(fā)現(xiàn)了PAS形成的早期步驟是如何組織的。另一個(gè)讓我們感興趣的研究領(lǐng)域是酵母的選擇性自噬機(jī)制。在這個(gè)領(lǐng)域，我們也能夠識(shí)別出各種目標(biāo)選擇的受體。小林仁志發(fā)現(xiàn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核降解的新型受體。

圖7. 2015年?yáng)|京大學(xué)大隅良典研究組成員

現(xiàn)在，我的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到自噬的生理意義上。 為了回到我職業(yè)生涯開(kāi)始時(shí)讓我著迷的原始問(wèn)題——自噬降解是什么、何時(shí)、如何以及為什么——我們需要系統(tǒng)地考慮細(xì)胞在各種環(huán)境條件下的存在。今年，我們?cè)跂|京工業(yè)大學(xué)成立了一個(gè)研究單位，并與川又友子（Tomoko Kawamata）擔(dān)任助理教授，我們現(xiàn)在正在運(yùn)行一個(gè)主要由博士后研究人員組成的實(shí)驗(yàn)室，這將是我最后一個(gè)實(shí)驗(yàn)室。在這里，我們正在努力解決那些我認(rèn)為對(duì)深化我們對(duì)自噬的理解非常重要的原始問(wèn)題。酵母仍然是一個(gè)極其強(qiáng)大的模式生物，隨著新的生物化學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，我相信我們?nèi)匀豢梢宰龀鲈S多開(kāi)創(chuàng)性的貢獻(xiàn)，特別是在確定自噬的誘導(dǎo)條件和各種模式方面。這些貢獻(xiàn)將不可避免地評(píng)估自噬降解產(chǎn)生的產(chǎn)物，它們從液泡中導(dǎo)出的機(jī)制，以及它們對(duì)細(xì)胞代謝的影響。作為一種基本的細(xì)胞過(guò)程，自噬直接和間接地與一系列細(xì)胞通路相關(guān)聯(lián)，而開(kāi)發(fā)能夠讓我們掌握這種機(jī)制微妙特征的定量方法至關(guān)重要。對(duì)自噬的更好理解有望幫助我們闡明遺傳學(xué)、表型和疾病之間的模糊關(guān)系。

自噬研究仍處于初級(jí)階段，特別是我們對(duì)自噬生理作用的理解還處在起步階段。 當(dāng)然，我很高興我們能夠揭示出有關(guān)自噬及其相關(guān)表型的如此復(fù)雜的細(xì)節(jié)，該領(lǐng)域吸引了世界各地的關(guān)注，這非常令人興奮。但我最感激的是多年來(lái)與我一起工作的許多優(yōu)秀的同事。我始終受好奇心驅(qū)使，而不是追求立即的實(shí)際成果，我很幸運(yùn)能與欣賞基礎(chǔ)研究重要性的博士后研究人員和研究生一起工作。他們中的許多人分享了我對(duì)研究困難項(xiàng)目的熱情，這些項(xiàng)目并不總是能立即得出結(jié)果，而令人欣慰的是，他們中的許多人繼續(xù)在各大學(xué)作為研究人員推動(dòng)這一領(lǐng)域的發(fā)展。多年來(lái)，我也非常幸運(yùn)能與許多合作者一起工作，他們?cè)谖覀兊难芯窟^(guò)程中給予了幫助。特別是我想提到兩位與我們合作了十多年，對(duì)Atg蛋白進(jìn)行系統(tǒng)性結(jié)構(gòu)分析的研究人員的貢獻(xiàn)：目前在日本微生物化學(xué)研究所工作的野節(jié)伸吾（Nobuo Noda）和令人遺憾的是在2016年去世的稻垣文彥（Fuyuhiko Inagaki）。我非常感謝他們多年來(lái)的合作。

圖8. 2016年大隅良典一家

我對(duì)自噬研究所表現(xiàn)出的興趣深感感動(dòng)，對(duì)我來(lái)說(shuō)，這代表了過(guò)去28年不可思議的旅程。 這一切要?dú)w功于對(duì)我們基礎(chǔ)研究的資助支持，這對(duì)我們的事業(yè)至關(guān)重要。如果我們的工作能夠觸發(fā)人們對(duì)生命的理解，那么作為基礎(chǔ)科學(xué)家，這將是我最大的快樂(lè)和榮幸。我滿懷期待地期待著該領(lǐng)域在未來(lái)的持續(xù)發(fā)展。

參考資料

Yoshinori Ohsumi Biographical.The Nobel Prize.

Deep Science預(yù)印本